dentyści pabianice

Komora przepływowa z równoległymi płytkami stosowana do adhezji leukocytów przy określonym przepływie laminarnym została szczegółowo opisana (41). Pokrótce, komora składa się z 2 płytek ze stali nierdzewnej oddzielonych silikonową uszczelką. Wymiary pola przepływu to 5 mm szerokości × 30 mm długości × 0,250 mm wysokości. Konfluentne komórki śródbłonka lub komórki CHO hodowane na okrągłych szklanych szkiełkach 25 mm (Fisher Scientific Inc., Medford, Massachusetts, USA) umieszczono w komorze przepływowej. Zdefiniowane poziomy przepływu zastosowano przez pobieranie mediów zawierających limfocyty B (106 / ml) przez komorę za pomocą pompy strzykawkowej (model 44, Harvard Apparatus Inc., Natick, Massachusetts, USA). Temperaturę utrzymywano na 37 ° C za pomocą płyt grzewczych. Aparat przepływowy został zamontowany na mikroskopie odwróconym Nikon Diaphot (Nikon, Toyko, Japonia), a cały czas perfuzji (6 minut dla każdego stanu) został nagrany na taśmie wideo za pomocą kamery wideo i magnetowidu. Komórki B uznawano za adherentne po 20 sekundach stabilnego kontaktu z monowarstwą. Zwinięcie komórek B było łatwo widoczne, ponieważ komórki poruszały się wolniej niż swobodnie płynące. Liczbę ruchomych komórek obliczono w 4 różnych polach w każdym punkcie czasowym każdego niezależnego eksperymentu. Prędkości walcowania obliczono za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania do analizy obrazu opartego na komputerze PC (OPTIMAS, Bioscan Inc., Edmonds, Washington, USA). W przypadku badań blokowania przeciwciał komórki B, HUVEC lub monowarstwy CHO inkubowano przez 20 minut z 10 .g / ml wskazanego przeciwciała i test przeprowadzono bez usuwania przeciwciała. Testy adhezji w warunkach rotacji przeprowadzono na 6-studzienkowych płytkach uprzednio pokrytych konfluentnymi monowarstwami CHO. Płytki umieszczono na wytrząsarce w warunkach rotacji 72 rpm i do każdej studzienki dodano 1,5 x 107 komórek B. Po 15 minutach inkubacji, studzienki przepłukano PBS w celu usunięcia niezwiązanych komórek, a następnie adherentne komórki usunięto przez dodanie ml 0,5 mM EDTA w PBS. Enzymatyczne traktowanie komórek B. W celu leczenia sialidazami, komórki B (107) przemyto, ponownie zawieszono w ml RPMI-1640, a następnie inkubowano przez godzinę w 37 ° C z neuraminidazą (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA) otrzymaną z Vibrio cholerae w 0.1. U / ml. Jako kontrolę, inną próbkę inkubowano w tych samych warunkach bez neuraminidazy. W przypadku endopeptydazy O-sialoglikoproteinowej (OSGE, Accurate Chemicals, Westbury, Nowy Jork, USA), limfocyty B były płukane w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco (DPBS) i ponownie zawieszane w stężeniu 107 komórek / ml w DPBS zawierającym 20 mM HEPES, 0,2 % FCS i 0,5 mM Ca2 + i Mg2 +. Trawienie za pomocą OSGE (40 .g / ml) prowadzono przez godzinę w 37 ° C. Próbę mock przeprowadzono w identycznych warunkach bez obecności tego enzymu. Immunoprecypitacja. Limfocyty B wyizolowane z ludzkich migdałków (3,5 x 107 komórek) przemyto 3 razy w PBS i powierzchniowo biotynylowano w ml PBS zawierającego 0,5 mg / ml Sulfo-NHS-biotyna (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA) przez 30 minut. na lodzie. Reakcję zablokowano przez inkubację komórek przez 10 minut w ml DMEM (GIBCO BRL) bez FCS na lodzie. Komórki dwukrotnie przemywano PBS i poddawano immunoprecypitacji w sposób opisany (26). W skrócie, porcję ekstraktu detergentu komórkowego odpowiadającego 107 komórkom B inkubowano z 20. L sefarozą A-białka obciążoną 5. G przeciwciała, selektyny / IgG lub białka fuzyjnego VE-kadheryna / IgG. W eksperymentach blokowania białko A-Sepharose sprzężone z E-selektyną / IgG dalej inkubowano przez 12 godzin z 400 .g UZ4 lub 28AG6. Mysie mAb były związane z białkiem A-Sepharose przez królicze anty-mysie IgG i inkubowane z podwielokrotnością lizatu komórkowego odpowiadającego komórkom 5 x 106 B
[przypisy: ciemnozielony stolec, mielopatia szyjna objawy, barszcz zwyczajny ]