laboratorium rogatka kalisz

Poszczególne typy komórek zapalnych zliczano w 10. 20 polach o wysokiej mocy (HPF) przy x 1,000 i wyrażano jako komórki na HPF, z obliczeniem średniej i SEM. Analiza immunohistologiczna. Skrawki skóry były osadzone w związku Tissue-Tek oxacalcitriol (OCT) (Miles Inc., Elkhart, Indiana, USA) na suchym lodzie. Skrawki o długości 4 .m przygotowano i przechowywano w temperaturze <80 ° C. Skrawki wybarwiono metodą awidyna-biotyna, jak opisano wcześniej (21, 23). Zabarwione komórki zliczono w 10. 20 HPF w. 400. Poziomy IL-5 w surowicy. Poziomy IL-5 były określane w surowicy przy użyciu komercyjnego testu kanapkowego ELISA z Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, Anglia). Czułość dla testu wynosiła 5 pg / ml. Analiza eozynofilów we krwi obwodowej. Krew pobierano 24 godziny po trzecim uczuleniu. Całkowitą liczbę eozynofili określono przez zliczenie heparynizowanej krwi na hemocytometrze po barwieniu za pomocą płynu Discombe (24). Przygotowanie RNA. Biopsję skóry uzyskano 24 godziny po usunięciu trzeciego plastra i natychmiast zamrożono w suchym lodzie. W celu ekstrakcji RNA, próbki homogenizowano w Trizol (GIBCO BRL, Grand Island, Nowy Jork, USA) stosując urządzenie Polytron RT-3000 (Kinematica AG, Littau, Szwajcaria). Ilość RNA określono przez pomiar OD przy 260 nm. synteza cDNA i amplifikacja PCR cDNA odwrotnego transkrypcji. cDNA zsyntetyzowano z 10 .g całkowitego RNA w mieszaninie reakcyjnej 50 .l, stosując Superscript II (GIBCO BRL) przez 90 minut w 37 ° C. Startery stosowane do amplifikacji cDNA dla a2-mikroglobuliny, IL-2, IL-4, IL-5, IFN-y i amplifikacji DNA były jak opisano wcześniej (21). W celu ilościowego oznaczenia mRNA, kohortowano stałą ilość mRNA komórkowej z odwrotną transkrypcją w obecności seryjnych rozcieńczeń wieloswoistej wewnętrznej kontroli plazmidu (pMUS), która zawiera sekwencje nukleotydowe z wielu cytokin (25). Wyniki wyrażano jako stosunek cDNA cytokiny do cDNA konstytutywnie eksprymowanego genu p2-mikroglobuliny. Test ochrony przed RNazą. Szablon wieloskładnikowy mCK-5 zawierający szablony DNA dla chemokin LTN, RANTES, eotaksyna, białko zapalne makrofagów-1. (MIP-1 a), MIP-2, MIP-1 (3, IFN-y indukowalne białko-10 (IP-10), białko chemotaktyczne monocytów-1 (MCP-1) i TCA-3, oraz do utrzymywania czystości geny L32 (rybosomalne RNA) i GAPDH (wszystkie z PharMingen). Test przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta. W skrócie, szablony DNA użyto do syntezy sond, znakowanych a – [32P] UTP (3000 Ci / mmol, 10. Ci /. L, Du Pont NEN Research Products, Boston, Massachusetts, USA), w obecności Pula GACU przy użyciu polimerazy T7 zgodnie z protokołem producenta. Sondę hybrydyzowano przez noc z 10 .g całkowitego RNA, a następnie strawiono RNazą A i T1. Próbki następnie potraktowano mieszaniną proteinaz K-SDS, ekstrahowano fenolem-chloroformem (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA) i wytrącono w obecności octanu amonu. Próbki naniesiono na żel sekwencjonujący akrylamid-mocznik obok niestrawionych sond do znakowania i analizowano przy 50 W za pomocą 0,5 x buforu do elektroforezy Tris-boran / EDTA (TBE). Żel osuszono na bibule filtracyjnej pod próżnią, eksponowano na folię XAR (Eastman Kodak Co., Rochester, New York, USA) z sitami intensyfikującymi i rozwijano w temperaturze ~ 70 ° C. W celu kwantyfikacji, żele skanowano za pomocą densytometru QuantiScan, a analizę pików integracyjnych przeprowadzono za pomocą oprogramowania ImageQuant. Każde pasmo było znormalizowane do L32 i GAPDH i wyrażone jako procent GAPDH + L32. Przeanalizowaliśmy duplikaty biopsji skóry od 10 myszy w każdej grupie. Wyniki Eozynofile są praktycznie nieobecne w miejscach skóry uwrażliwionych na OVA IL-5. /. myszy. Wcześniej wykazaliśmy, że uczulenie na skórę przez OVA indukowało znaczne zgrubienie skóry właściwej, naskórka i nacieku komórkowego w skórze właściwej (Tabela 1), która zawierała limfocyty T, eozynofile i komórki tuczne (tabele 2 i 3).
[patrz też: ziarnica złośliwa i chłoniaki nieziarnicze, ziemia okrzemkowa allegro, rozpoznanie wg icd 10 ]