Mutacje CDKN2A w wielu pierwotnych czerniakach ad 5

Pięć mutacji (Figura 2A, Figura 2B, Figura 2C, Figura 2D, Figura 2E i Figura 2F) zawierało insercję o 24 bp na początku eksonu 1, co spowodowało dodanie ośmiu aminokwasów do końca aminowego końca białko CDKN2A, delecja 2 nukleotydów 307 do 308 o długości 2 pz, która spowodowała przedwczesny sygnał terminacji w kodonie 117, i trzy mutacje missense: podstawienie C dla G przy nukleotydzie 71 (Arg24Pro), podstawienie C dla G w nukleotyd 159 (Met53Ile) i podstawienie T przez G na nukleotydzie 167 (Ser56Ile). W celu potwierdzenia tych wyników analizowano drugą próbkę krwi od każdego z pięciu pacjentów. Egzon CDKN2A niosący odpowiednią mutację amplifikowano przez PCR, subklonowano i sekwencjonowano. Chociaż badania przesiewowe SSCP są ogólnie uważane za mniej czuły sposób wykrywania mutacji niż sekwencjonowanie DNA, jest to technicznie proste i zostało zastosowane w wielu badaniach w celu zbadania mutacji CDKN2A. Chociaż nie jest to nieoczekiwane, nasze obserwacje wskazują, że bezpośrednia analiza sekwencji DNA genu CDKN2A daje mniej wyników fałszywie ujemnych niż analiza SSCP. Wszyscy pacjenci z mutacjami linii zarodkowej CDKN2A rezydowali w większym obszarze Toronto. U dwóch z tych pacjentów uprzednio zdiagnozowano jeden inwazyjny czerniak i jeden czerniak in situ, podczas gdy u pozostałych trzech pacjentów zdiagnozowano dwa lub więcej inwazyjnych czerniaków.
Wyniki testu podwójnej hybrydy drożdży
Zmiana w sekwencji linii zarodkowej genu CDKN2A niekoniecznie zmienia funkcję odpowiedniego białka. Aby pomóc w rozróżnianiu klinicznie istotnych mutacji linii zarodkowych od wariantów polimorficznych, które zwykle nie wpływają na funkcję białka, użyliśmy drożdżowego systemu dwuhybrydowego do zmierzenia wiązania CDKN2A z jednym z jego celów: cdk4. Dwupierścieniowy system drożdżowy wykorzystuje fakt, że wiele aktywatorów transkrypcji ma dwie różne domeny: lokalną domenę wiążącą DNA i domenę aktywacyjną. Gdy dwie domeny są rozdzielone, aktywator transkrypcji jest nieaktywny. Aby ocenić interakcję pomiędzy dwoma białkami, każda domena jest oddzielona i połączona z jednym z dwóch białek. Jeśli te dwa białka oddziałują, aktywator transkrypcji jest odtwarzany, co powoduje ekspresję genu reporterowego. W naszym teście, formy dzikiego typu lub zmutowane CDKN2A poddano fuzji z domeną aktywacyjną pochodzącą z białka VP16 wirusa opryszczki pospolitej, a CDk4 typu dzikiego połączono z domeną wiążącą DNA E. coli LexA (Figura 1A i Figura 1B). ). Wiązanie CDKN2A z cdk4 spowodowało ekspresję genu reporterowego, a jego produkt określono ilościowo za pomocą testu kolorymetrycznego.
Figura 3. Figura 3. Aktywność wiązania zmutowanych białek CDKN2A w dwuskładnikowym drożdżowym badaniu drożdżowym. Aktywność wiązania różnych zmutowanych białek została znormalizowana do tej otrzymanej dla konstruktu typu dzikiego. Delecja 6-bp jest wcześniej opisaną delecją w ramce24, o której wiadomo, że jest związana z niedoborem wiązania z cdk4. Pokazano średnie (. SE) z trzech eksperymentów.
Cztery z pięciu wariantów CDKN2A zmniejszyły wiązanie z cdk4, z aktywnością wiązania w zakresie od 2 procent do 11 procent, w porównaniu z formą CDKN2A typu dzikiego (figura 3).
[przypisy: ceftriakson, oprogramowanie stomatologiczne, ambroksol ]
[patrz też: zespol retta, zespół tietza, ziemia okrzemkowa allegro ]