Mutacje CDKN2A w wielu pierwotnych czerniakach ad

33 pacjentów nie było ze sobą spokrewnionych, wszyscy byli biali, a ich wiek wahał się od 21 do 67 lat. Wszyscy z wyjątkiem dwóch pacjentów przebywali w rejonie Toronto. Pacjenci byli szczegółowo pytani o możliwą rodzinną historię czerniaka złośliwego lub raka trzustki, a wszystkie 33 osoby nie zgłosiły żadnej wiedzy na temat historii raka. Pisemną świadomą zgodę uzyskano od wszystkich pacjentów. Analiza łańcuchowa polimerazy i analiza polimorfizmu jednoniciowych konformacji
Tabela 1. Tabela 1. Primery użyte w badaniu. DNA leukocytów ekstrahowano z próbek krwi obwodowej za pomocą standardowych metod. Egzony 1. i 2 genu CDKN2A amplifikowano za pomocą starterów wymienionych w tabeli 1. Mieszanina reakcyjna dla reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) składała się z 0,5 U DNA polimerazy Taq (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD), x bufor do PCR (20 mM TRIS kwas solny, pH 8,4 i 50 mM chlorek potasu), 1,5 mM chlorek magnezu, 0,2 mM trifosforan deoksynukleozydu, mM starterów do przodu i do tyłu, 0,05 uCi [.-32P] trifosforanu deoksycytydyny, i 100 ng DNA od pacjenta (reakcje PCR dla eksonu 1. również zawierały 10 procent dimetylosulfotlenku). Próbki denaturowano w 95 ° C przez 5 minut, a następnie poddawano 35 cyklom denaturacji przez minutę w 95 ° C, hybrydyzacji w temperaturze od 58 do 61 ° C przez minutę i wydłużaniu w 72 ° C przez 2 minuty, a następnie końcowy okres wydłużania w temperaturze 72 ° C przez 2,5 minuty. Ponieważ czułość analizy jednorodnikowej konformacji polimorfizmu (SSCP) w wykrywaniu mutacji ma tendencję do zmniejszania się wraz ze wzrostem wielkości produktu PCR, fragmenty większe niż 300 bp były trawione odpowiednimi endonukleazami restrykcyjnymi. Reakcje zatrzymano przez dodanie równej objętości buforu stopu (95% formamidu, 20 mM EDTA, 0,05% błękitu bromofenolowego i 0,05% ksyleno-cyanolu), a próbki denaturowano w 98 ° C (ekson 1.) lub 95 ° C (ekson 2) przez pięć minut, a następnie ochłodzono na lodzie. Fragmenty DNA rozdzielano elektroforetycznie w temperaturze pokojowej na 6 procentowym nieoddarzającym się żelu poliakrylamidowym (uzupełnionym 10 procentowym glicerolem) przy 6 W przez 12 do 18 godzin. Po elektroforezie żele wysuszono i poddano działaniu filmu autoradiograficznego przez 8 do 48 godzin.
Sekwencjonowanie DNA
Wszystkie próbki DNA zostały również zbadane przez bezpośrednie sekwencjonowanie. Przeprowadzono PCR, jak opisano powyżej, przy użyciu znakowanych M13 starterów ME1-F i ME1-R dla eksonów 1. i ME2-F i ME2-R dla eksonu 2. Produkty PCR rozdzielono elektroforetycznie na 2% żelach agarozowych i oczyszczono za pomocą zastosowanie zestawu do ekstrakcji z żelu Qiaex II (Qiagen, Chatsworth, CA). Obie nici produktów PCR sekwencjonowano za pomocą odpowiedniego zestawu starterów M13 i analizowano za pomocą analizatora genetycznego ABI Prism 310 (Perkin-Elmer, Foster City, CA). Aby potwierdzić obecność mutacji specyficznych dla allelu, wszystkie próbki DNA wykazujące warianty pasm SSCP lub sekwencje heterozygotyczne lub oba zostały ponownie amplifikowane z użyciem specyficznych primerów dla eksonów 1. i eksonu 2 (ekson 1., E1-F i E1-R, eksonu 2 E2-F i E2-R). Powstałe produkty ligowano do wektora klonującego pCR-Script Amp SK (+) (Stratagene, La Jolla, CA) i sekwencjonowano przy użyciu zestawu ABI Prism Dye Terminator (Perkin-Elmer).
Dwuwirusowy test drożdży
Rysunek 1
[podobne: dabrafenib, ambroksol, ambrisentan ]
[podobne: ciemnozielony stolec, mielopatia szyjna objawy, barszcz zwyczajny a sosnowskiego różnice ]