Mutacje CDKN2A w wielu pierwotnych czerniakach cd

Badanie drożdżowych dwóch hybryd. CDk4 typu dzikiego poddano fuzji z domeną wiążącą DNA (BD) pochodzącą z bakteryjnego czynnika transkrypcyjnego LexA, która wiąże określone sekwencje w górnym miejscu aktywacji (UAS) genu reporterowego. CDKN2A połączono z domeną aktywacyjną (AD) pochodzącą z czynnika transkrypcyjnego wirusa opryszczki pospolitej. Wiązanie cdk4 z CDKN2A (panel A) odtwarzało aktywator transkrypcji i powodowało ekspresję genu reporterowego. Poziom produktu reportera-genu oznaczono następnie ilościowo za pomocą testu kolorymetrycznego. Zmutowana CDKN2A nie miała zdolności wiązania się z CDk4 typu dzikiego i nie odtwarzała aktywatora transkrypcji, co skutkowało małą ekspresją lub brakiem ekspresji genu reporterowego (Panel B). Dwupierścieniowy test drożdżowy22 zastosowano do oceny interakcji między różnymi wariantami CDKN2A i cdk4. Jak pokazano na Figurze 1A i Figurze 1B, ten test mierzy rekonstytucję funkcjonalnego aktywatora transkrypcyjnego z dwóch oddzielnych białek fuzyjnych: CDKN2A połączony z domeną aktywacyjną (pochodzącą z białka VP16 wirusa opryszczki pospolitej) i cdk4 połączony z wiązaniem DNA. domena (pochodząca z białka LexA Escherichia coli).
Drugą próbkę krwi obwodowej uzyskano od każdego pacjenta z mutacją CDKN2A z linii zarodkowej, a RNA z leukocytów wyekstrahowano za pomocą zestawu RNeasy Total RNA (Qiagen). Pierwszą nić komplementarnego DNA (cDNA) zsyntetyzowano z 3 do 5 .g całkowitego RNA i 500 ng oligo-dT16, jak opisano przez producenta (GIBCO BRL). Pierwszy PCR przeprowadzono w x standardowy bufor PCR, 2,5 mM chlorek magnezu, 0,2 mM trifosforan deoksynukleozydu, 5 procent dimetylosulfotlenku, 0,5 mM każdy z cDNA-F i cDNA-R (Tabela 1), 0,5 U polimerazy Taq, i .l mieszaniny cDNA. Mieszaninę ogrzewano do 95 ° C przez pięć minut, a następnie poddawano 30 cyklom w 95 ° C przez jedną minutę, 58 ° C przez jedną minutę i 72 ° C przez dwie minuty, a następnie wydłużono w 72 ° C. przez pięć minut. Zagnieżdżony PCR przeprowadzono następnie z użyciem pierwszego produktu PCR jako matrycy, razem z syntetycznymi oligonukleotydami zawierającymi miejsca klonowania restrykcyjne Bgl II lub Notl (po 0,4 mM E1-Bgl II-F i E3-Notl-R) (Tabela 1) i te same stężenia reakcji, które zastosowano w pierwszej reakcji PCR. Warunki dla nested PCR składały się z początkowego okresu denaturacji 95 ° C przez pięć minut, następnie 35 cykli w 95 ° C przez jedną minutę i 68 ° C przez trzy minuty, i końcowego okresu przedłużania w 72 ° C przez siedem minut . Uzyskane fragmenty DNA oczyszczono i poddano automatycznemu sekwencjonowaniu przed analizą. cDNA kodujący zmutowaną postać CDKN2A z insercją o 24 bp był dostarczany przez G. Petersa (Imperial Cancer Research Fund Laboratories, Londyn).
Pełne warianty alleliczne CDKN2A wytworzone przez PCR z odwrotną transkrypcją strawiono Bgl II i Not I, oczyszczono, a następnie ligowano w ramce do wektora cDNA pVP16 (dar od S. Hollenberg, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle) w celu uzyskania plazmidu pVP16 / p16.
CDNA cdk4 typu dzikiego (dar G. Hannona i D. Beach, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) zligowano w ramce z E
[przypisy: Leukocyturia, bromazepam, buprenorfina ]
[podobne: lunchbox allegro, guzkowe zapalenie tętnic, barszcz zwyczajny ]