nadmierna męczliwość

Tkanki maziowe uzyskano w czasie całkowitego zastąpienia kolana u 12 pacjentów z RA i 3 OA. Część każdej tkanki podzielono na 3 małe kawałki (1 g) dla hodowli narządów i dobrze przepłukano PBS (pH 7,4). Każdy kawałek tkanki błony maziowej hodowano w ml RPMI-1640 (GIBCO BRL, Gaithersburg, Maryland, USA) zawierającym 100 jednostek / ml penicyliny, 10 .g / ml streptomycyny i 2 mM L-glutaminy przez 3 dni. w 5% CO2 w powietrzu w 37 ° C. Supernatanty hodowli zebrano i trzymano zamrożone w <80 ° C aż do użycia do pomiaru zawartości IL-17 za pomocą zestawu ELISA (BioSource International, Camarillo, Kalifornia, USA). Obliczono średnią wartość stężenia IL-17 3 maziówek z pojedynczego stawu. Z każdego pacjenta przygotowano zamrożone skrawki i zastosowano do barwienia immunohistologicznego i TRAP. Pożywki hodowlane tkanek maziowych (40 ul) od pacjentów z RA dodano wraz z lub bez przeciwciała przeciw ludzkiemu IL-17 (1. G / ml) do współhodowli (200. L) osteoblastów i komórek szpiku kostnego. Po hodowli przez 7 dni policzono liczbę OCL pozytywnych wobec TRAP. W kontrolnych hodowlach traktowanych króliczymi IgG nie tworzyły się żadne OCL (5 (ig / ml; Endogen Inc., Woburn, Massachusetts, USA). Wykorzystaliśmy media hodowlane w tkankach maziowych zamiast w płynie maziowym, aby zbadać wpływ cytokin wytwarzanych przez tę samą ilość tkanek maziowych pobranych od różnych pacjentów z RA. IL-17 w płynach maziowych. Płyny maziówkowe uzyskano od 43 pacjentów z RA, 9 pacjentów z OA, 4 pacjentów z urazem i 7 pacjentów z dną przez artroprocesę w heparynizowanych fiolkach. Płyny maziowe (10 ml) potraktowano następnie hialuronidazą (0,3 ml, 200 j./ml; Mochida, Tokio, Japonia) w celu zmniejszenia lepkości. Ilość IL-17 w płynie maziowym mierzono za pomocą zestawu ELISA (BioSource International) zgodnie z instrukcjami producenta. Barwienie immunohistologiczne. Próbki tkanki maziowej utrwalone w związku OCT i zamrożone pocięto na sekcje (7 .m). Aktywność endogennej i egzogennej peroksydazy blokowano przez umieszczanie fragmentów tkanek w 1% kwasie nadjodowym w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie dokładne przemywanie PBS. Do podwójnego barwienia przeciwciało anty-IL-17 (R & D Systems Inc.) oraz CD4, CD8 i CD45RO (DAKO A / S, Glostrup, Dania) zastosowano jako przeciwciała pierwotne odpowiednio przy rozcieńczeniach 1: 300 i 1:50, z inkubacją przez noc w 4 ° C. W przypadku przeciwciała drugorzędowego po raz pierwszy zastosowano inkubację peroksydazy IgGa anty-kozy (Laboratoria medyczne i biologiczne, Nagoya, Japonia) (rozcieńczenie 1: 300) z inkubacją w temperaturze pokojowej przez 60 minut i uzyskano kolor za pomocą 3,3. tetrachlorowodorek diaminobenzydyny (DAB). Następnie, dla przeciwciała drugorzędowego, użyto sprzężone z FITC mysie immunoglobuliny (DAKOPATTS Japan Ltd., Kioto, Japonia) (rozcieńczenie 1: 300) z inkubacją w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Zostały zbadane za pomocą mikroskopii świetlnej i fluorescencyjnej. Analiza Northern blot. Całkowity komórkowy RNA wyekstrahowano z osteoblastów przy użyciu Trizol (GIBCO BRL). W przypadku Northern blot, 20 .g całkowitego RNA rozdzielono przez elektroforezę w 1% żelu agarozo-formaldehydowym i przeniesiono na membranę Hybond-N (Amersham Life Sciences Inc., Arlington Heights, Illinois, USA). Błonę hybrydyzowano z sondami cDNA znakowanymi 32P dla mysiego ODF (18), OCIF (15) i (3-aktyny. Zhybrydyzowane sondy usunięto z membrany przez gotowanie w 0,2% SDS, a następnie sekwencyjnie ponownie hybrydyzowano z odpowiednimi sondami. Analiza statystyczna. Dane analizowano za pomocą testu Kruskala-Wallisa, testu U Manna-Whitneya i testu Studenta (StatView, Abacus Concepts Inc., Berkeley, California, USA). Znaczenie różnicy określono jako P <0,01 [więcej w: zespol retta, guzkowe zapalenie tętnic, lunchbox allegro ]