szczepionki skojarzone koszt

Taką samą ilość lizatu komórkowego zastosowano do immunoprecypitacji z użyciem przeciwciał króliczych. Immunoprecypitowane białka rozdzielono przez elektroforezę na 6% SDS-PAGE i przeniesiono na nitrocelulozę (Schleicher & Schüll, Dassel, Niemcy). Filtry analizowano pod kątem biotynylowanych białek ze sprzężoną z peroksydazą streptawidyną (Dianova, Hamburg, Niemcy) i ulepszonym systemem chemiluminescencji (ECL) (Amersham Life Sciences Inc., Arlington Heights, Illinois, USA). Leczenie endoglikozydazą F liganda E-selektyny. Ligand E-selektyny 240 kDa był wyizolowany przez powinowactwo z limfocytów Tonsilar B znakowanych biotyną, jak już tu opisano, i był eluowany 10 mM EDTA, 150 mM NaCl i 0,05% Triton X-100. Łącznie 20 ul eluatu EDTA odpowiadającego 5 x 106 komórek odłożono na bok dla PAGE; 60 ul eluatu odpowiadającego 15 x 106 komórek strawiono 0,5 U (10 ul) endoglikozydazy F (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Niemcy) przez 12 godzin w 37 ° C. Próbę pozorowaną przeprowadzono w identycznych warunkach bez obecności enzymu. Jedna trzecia próbki strawionej lub pozorowanej została odstawiona na PAGE, podczas gdy pozostałe dwie trzecie ponownie inkubowano z A-sefarozą białka E selektyny / IgG w obecności 20 mM CaCl2 przez 3 godziny, a następnie przemyto i eluowano EDTA, jak już opisano tutaj. Półilościowy RT-PCR i analiza Southern blot. Całkowity komórkowy RNA wyizolowano z 107 komórek, stosując Trizol (GIBCO BRL) zgodnie z instrukcjami producenta. Odwrotną transkrypcję .g całkowitego komórkowego RNA RNA potraktowano jak opisano wcześniej (21, 45). Reakcje PCR zawierające 5 .l odpowiedniej reakcji RT w końcowej objętości reakcji 100 .l zawierającej 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM każdy dNTP, 0,5 mM specyficznego sensownego i antysensownego startera i 2,5 U Taq polimerazy (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, Connecticut, USA) przeprowadzono z następującymi parametrami cyklu: minuta w 94 ° C, minuta w 65 ° C i minuta w 72 ° C, przez 35 cykli (FucT-VII), 25 cykli (pgk1). ) lub 30 cykli (C2GnT i FucT-IV). Startery były następujące: do wykrywania mRNA FucT-VII, sens. 5 (3 -CCC ACC GTG GCC CAG TAC CGC TTC T-3. i antysensowny 5 (3-CTG ACC TCT GTG CCC AGC CTC CCG T-3y; do detekcji FucT-IV, sens 5-CGG GTG TGC CAG GCT GTA CAG AGG-3. i antysensowny 5 (3 -TCG GGA ACA GTT GTG TAT GAG ATT-3 .; do wykrywania C2GnT, sens 5 (3 -TTT TCW GGC AGT GCC TAC TTC GTG GTC i antysensownego 5 (3-ATG CTC ATC CAA ACA CTG GAT GGC AAA; dla wykrywania pgk1, sens 5. -ATG ATT ATT GGT GGT GGA ATG GCT-3. i antysensowny 5a-TCA TCC ATG AGA GCT TTG GTT CC-3 .. Startery FucT-VII zamplifikowały produkt o wielkości 500 pz; FucT-IV, produkt 480 pz; pgk1, produkt 374 pz; i C2GnT, produkt 372 pz. Obecność produktów PCR badano za pomocą elektroforezy żelowej w 1,4% agarozy. DNA przeniesiono na nitrocelulozę w 10 x SSC, a hybrydyzację Southerna produktów RT-PCR przeprowadzono przy użyciu sond losowo zagruntowanych, jak opisano wcześniej (21, 45). Wyniki Rolowanie limfocytów z migdałkiem B w śródbłonku za pośrednictwem selektyny za pośrednictwem E-selektyny. Aby zbadać, czy można wyróżnić różne subpopulacje komórek B we wtórnych narządach limfatycznych w oparciu o ich różnicowe interakcje komórkowe za pośrednictwem selektyny, przeprowadziliśmy testy adhezji oczyszczonych nieaktywowanych nieaktywnych komórek migdałkowych B do HUVEC w warunkach przepływu. Bardzo niewiele kontaktów adhezyjnych zachodziło pomiędzy komórkami B a kontrolowaną nieaktywną monowarstwą HUVEC. Przeciwnie, wiele spoczynkowych migdałowatych komórek B było zdolnych do zetknięcia się, przechylenia, a następnie zatrzymania na 4-godzinnych monowarstwach HUVEC aktywowanych TNF-a. Badanie komórek B w kontakcie ze śródbłonkiem po 5 minutach perfuzji ujawniło, że 23% komórek B toczyło się po powierzchni monowarstwy, a pozostałe komórki zostały zatrzymane po okresie walcowania (rysunek 1a)
[przypisy: euromedic olsztyn, zespół tietza, ziemia okrzemkowa allegro ]